多克隆抗體(polyclonal antibody, pAb):用種包含多種抗原決定簇的抗原免疫動物,可刺激機體多個B細胞克隆,產生針對多種抗原表位的不同抗體。所獲得的免疫血清實際上是含有多種抗體的混合物,即多克隆抗體。單克隆抗體是由單B細胞克隆產生的高度均、僅針對某特定抗原表位的抗體,稱為單克隆抗體。通常采用雜交瘤技術來制備,雜交瘤(hybridoma)抗體技術是在細胞融合技術的基礎上,將具有分泌特異性抗體能力的致敏B細胞和具有無限繁殖能力的骨髓瘤細胞融合為B細胞雜交瘤。
、單多抗優缺點
類型 | 優點 | 缺點 |
多克隆抗體 | 1.多克隆抗體有助于放大低表達水平的靶蛋白信號; 2.能識別多個表位; 3.比單克隆抗體能容許抗原中的微小變化; 4.識別出與免疫原蛋白質具有高同源性的蛋白質,或者從非免疫原物種的組織樣品中篩選靶蛋白; 5.多克隆抗體通常是檢測變性蛋白質的; 6.多表位通常可提供為有力的檢測。 | 1.易于產生批次間差異; 2.產生非特異性抗體,有時可能在某些應用中產生背景信號; 3.不適用于探測抗原的特定結構域,因為抗血清通常可識別多個結構域。 |
單克隆抗體 | 1.雜交瘤制得后,就成為了恒定的再生源,所有批次都將相同; 2.切片和細胞染色造成的背景較低。 3.具有特異性,適于分析測定中的抗或檢測組織中的抗原,并且通常所產生的背景染色顯著低。 4.同質性非常高; 5.單克隆抗體的特異性能使其在混合物中和抗原地結合。 | 1.可產生特異性抗體,但可能特異性過強; 2.經過抗原的化學處理后比多克隆抗體易于丟失表位。這可通過使用同抗原的兩個或多個單克隆抗體進行補償。 |
二、單抗和多抗的選擇
如果對抗體的特異性要求高,用量較大或需要使用致的抗體,制備的抗體應用要求多(WB/IP/IF/ICC等),可以選擇制備單克隆抗體。
多克隆抗體的特異性較差,即使是使用相同的抗原制備多抗,不同批次間也會存在差異,因而在特異性、致性方面有很大的局限。所以在用多抗做免疫檢測時,容易造成背景,例如在WB 中有雜帶,在IHC 中背景較深等等。雖然還存在著交叉反應的問題,但由于多抗識別多個抗原表位,即使是有少數幾個抗原表位被破壞或者抗原構象改變,實驗的結果也不會受到影響。另外多抗需要免疫原的量大,如果免疫原制備困難,建議制備單抗。
若對抗體的特異性要求不高,需要做沉淀和凝集反應的檢測性實驗或者只需做ELISA檢測,可以選擇制備多克隆抗體。
多抗相比較單抗仍然有制備時間短、制備成本低的特點,在些情況下也是種選擇。另外,在相同條件下,使用多抗可以提高檢測的靈敏度,對于豐度偏低的蛋白也容易檢出。
三、抗原的選擇
抗原的選擇可以是天然蛋白、重組可溶蛋白、重組變性蛋白和多肽,抗原質量越高,終制備高質量抗體的幾率也會越大! 目前抗體制備常采用重組蛋白或多肽作為抗原。
常規情況下,重組蛋白作為抗原往往含有多的抗原決定簇,既有空間表位,也會有線形序列表位,對于機體的免疫刺激也會相對充分些,那么終獲取應用面較廣的抗體幾率也會大很多,尤其是目的蛋白已證明有修飾或者復雜結構的,般都會優先選擇重組蛋白。
當然也有必須用多肽制備的,比如對同源家族某個蛋白抗體的制備,同源性非常高的,需要找到特異性aa合成多肽,再或者些修飾化抗體,需要在多肽合成階段定點修飾某些AA來制備抗體。抗原多肽選擇般遵循如下基本原則1.盡可能是在蛋白表面;2.該段序列不形成α-helix;3.N,C端的肽段比中間的肽段好;4.避免蛋白內部重復或接近重復段的序列;5.避免同源性太強的肽段;6.交聯可以交聯在N,C兩端,選擇依據就是交聯在對產生抗體不太重要的端;7.序列中不能有太多的Pro,但有兩個Pro有好處,可以使肽鏈結構相對穩定些,對產生特異性抗體有益。
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